Как проводится ПЦР диагностика

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяется при инфекционных болезнях. Главным преимуществом этой методики является возможность выявить скрытые инфекции и заболевание на раннем этапе, когда еще нет клинических и лабораторных признаков болезни.

Содержание

• 1 Что такое ПЦР-анализ
  • 1.1 Суть исследования
  • 1.2 Спектр применения
  • 1.3 Вариации метода
• 2 Сбор материала для диагностики
  • 2.1 Что делать перед исследованием
  • 2.2 Как берут материал на анализ методом ПЦР у мужчин
  • 2.3 Сбор материала у женщин
• 3 Этапы реакции
  • 3.1 Денатурация
  • 3.2 Отжиг праймеров
  • 3.3 Синтез ДНК
• 4 Сколько делается анализ и как проводится расшифровка результатов
• 5 Достоинства и недостатки метода

Что такое ПЦР-анализ

Исследуемый образец помещают в специальную среду со строго заданными условиями. К материалу добавляют ферменты, участвующие в репликации отдельного участка ДНК и РНК возбудителя. Реакция повторяется до тех пор, пока не станет возможным идентифицировать вид инфекционного агента. ПЦР-диагностика инфекций считается самым информативным, точным и высокочувствительным диагностическим методом.

Суть исследования

Сборка цепочки нуклеотидов в ДНК происходит при участии фермента ДНК-полимеразы. К исследуемому биологическому материалу добавляются:

• термостабильный фермент;
• ионы магния;
• смесь нуклеотидов;
• праймеры.

Эта смесь помещается в особые температурные условия в термоциклер (амплификатор). Прибор последовательно нагревает или охлаждает пробирки. Во время одного температурного цикла происходит сборка 2 фрагментов ДНК. Чтобы накопилось достаточное для идентификации количество генетического материала, температурный цикл повторяют 25-35 раз.

Спектр применения

Сферы применения ПЦР включают:

• клиническую медицину;
• экологию;
• криминалистику и судебную медицину;
• фармакологию;
• ветеринарию;
• научные исследования.

Клиническая медицина использует ПЦР в:

1. Урологии и гинекологии для выявления vaginalis mycoplasma genitalium, gonorrhoeae trichomonas, vaginalis gardnerella, vaginalis candida, ИППП 7, chlamydia gonorrhoeae, ureaplasma urealyticum u parvum, ДНК chlamydia trachomatis, Сandida albicans, genitalium cmv h (hominis) и другие штаммы ВПЧ.
2. Неонатологии для выявления врожденных инфекций, генетических мутаций, инфицирования при прохождении родовых путей у ВИЧ-инфицированных матерей, для обнаружения микоплазмы, хламидии, РНК HCV, Neisseria spp, вирусов папилломы, краснухи, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр (вируса герпеса 4 типа), токсоплазмы и др.
3. Фтизиатрии и пульмонологии для выявления туберкулеза, pneumoniae, хламидии, микоплазмы и др.

Вариации метода

Сегодня используются следующие варианты ПЦР:

• количественная;
• секвенирование – позволяет прочесть сразу несколько участков ДНК;
• пиросеквенирование – определение последовательности присоединения нуклеотидов в реакции амплификации путем их поочередного добавления.

Кроме стандартного метода, используется ПЦР в модификации FLASH, позволяющая проводить идентификацию инфекционного агента, не открывая пробирки. Это исключает риск загрязнения пробы и повышает информативность, чувствительность метода.

Широко применяется MLPA. Аббревиатура расшифровывается как мультиплексная амплификация зонда, синтезируемого лигазой. В реакции используется только 1 пара праймеров, что удешевляет и упрощает анализ. При этом происходит копирование не отдельного участка ДНК, а мультиплексной смеси лигированных зондов разной длины.

Сбор материала для диагностики

Для проведения анализа используется любой материал, содержащий ДНК:

1. Соскоб из уретры, цервикального канала, дыхательных путей, зева, конъюнктивы. Материал берется с поверхности слизистой с помощью особого ершика и помещается в стерильную емкость. В пробу не должна попасть кровь пациента. ПЦР соскоб используют для выявления урогенитальных, пульмонологических, офтальмологических и лор-инфекций.
2. Мокрота – ее отбирают в стерильную герметичную емкость для проведения анализа на туберкулез и другие респираторные инфекции.
3. Моча – в стерильную емкость отбирают 50 мл утренней мочи. Анализ можно сдать для выявления урогенитальных инфекций.
4. Кровь, плазма, сыворотка – кровь на ПЦР сдается из вены в объеме 1-1,5 мл на голодный желудок. Образец хранят при +4°С в течение 24 часов.
5. Биологические жидкости (слюна, амниотическая, спинномозговая, внутрисуставная, плевральная, простатическая). Забор производят с помощью пункции.
6. Биоптат. Отбирают его из органов ЖКТ для определения Helicobacter pylori или из других органов для идентификации онкологических заболеваний.

Что делать перед исследованием

Подготовка к ПЦР зависит от вида отбираемого материала. Например, перед ПЦР крови необходимо:

• есть не позже 8-10 часов до забора;
• не курить за 2 часа, не пить алкоголь за 1-2 дня;
• не принимать препараты за 24 часа;
• не волноваться, избегать физических нагрузок.

Чтобы при соскобе из урогенитального тракта получить достоверный результат, нельзя:

• вступать в половые отношения позже 2 дней до анализа;
• проводить спринцевание;
• мочиться позже 3 часов до процедуры;
• использовать химические ПАВ с антибактериальными свойствами для обмывания гениталий.

Не проводят отбор материала у женщин во время менструации.

Как берут материал на анализ методом ПЦР у мужчин

Если кровь, другие биологические жидкости и биоптаты отбираются без учета гендерных отличий, то при заборе материала из половых и мочевыводящих путей особенности мужского и женского организма учитываются. Соскоб из уретры для проведения ПЦР у мужчин делают так:

• с помощью мыла и воды производят туалет половых органов;
• наружный покров органа обрабатывают физраствором и подсушивают салфеткой;
• осторожно вводят стерильный зонд на 2-4 см в канал;
• вращательным движением производят забор биоматериала и помещают его в транспортный раствор в стерильном контейнере, отдают в лабораторию.

Делать соскоб нужно осторожно, чтобы не повредить слизистую, имеющую морфофункциональные нарушения, обусловленные имеющимся заболеванием мочеполовой системы.

Сбор материала у женщин

Для подтверждения патологий женской репродуктивной системы соскоб делают со слизистой влагалища или цервикального канала. Для отбора материала применяют специальный инструмент в виде щеточки или ватную палочку. Предварительно удаляют слизь. Полученный образец помещают в стерильный сосуд с физраствором для транспортировки в лабораторию.

Этапы реакции

Полимеразная реакция протекает в несколько этапов. Для каждого необходим особый набор реактивов и применение специальной аппаратуры.

Денатурация

На начальном этапе исследуемый образец помещают в амплификатор и нагревают пробирку до +95°С. Под действием высокой температуры цепочки ДНК расплетаются и расходятся. Время реакции денатурации составляет 1-2 минуты.

Отжиг праймеров

На втором этапе происходит выделение необходимого для репликации участка с помощью комплементарных короткоцепочечных синтетических праймеров. Процесс происходит при температуре, определяемой составом веществ.

Синтез ДНК

Фермент ДНК-полимераза начинает выстраивать цепочку из комплементарных выделенному фрагменту нуклеотидов. Элонгация начинается от 3’-ОН-затравки и двигается в направлении 5’-3’. Реакция протекает при +72°С. Продолжительность этапа репликации зависит от длины синтезируемого участка.

Сколько делается анализ и как проводится расшифровка результатов

Время готовности анализов на ПЦР зависит от примененной модификации. Самый быстрый результат дает использование количественной реакции – сроки выполнения не превышают 60 минут.

Результаты должны расшифровываться только специалистом. Он указывает в бланке:

• ПЦР отрицательный – означает отсутствие генетического материала инфекционного агента;
• положительный – показывает наличие патогена.

Значение анализа может быть ложноположительным или ложноотрицательным вследствие ошибок при взятии, транспортировке или хранении взятого материала. Важно брать материал непосредственно в месте локализации возбудителя. Например, для выявления Chlamydia trachomatis пробы можно взять из урогенитального тракта, конъюнктивы или синовиальной полости. Если сделать исследование крови, то отрицательный результат не означает, что здоровье в норме.

Ошибки могут быть и на этапе проведения анализа ПЦР-инфекции:

• выбор тест-системы для разных биоматериалов;
• неправильный выбор фоновых пробирок и добавление в них полимеразы.

В таком случае все отрицательные результаты будут недостоверными. Неаккуратное обращение с положительными образцами тоже приводит к искажению результата. Если исследование сделано с нарушением технологии, то произойдет контаминация (загрязнение) образца.

Достоинства и недостатки метода

К преимуществам ПЦР относятся:

1. Универсальность – можно анализировать любые биоматериалы, имеющие ДНК или РНК, причем оборудование используется одно при проведении различных проб.
2. Специфичность – метод позволяет выявить вид патогена, причем в одном и том же материале можно проводить анализ на разных возбудителей без искажения результата.
3. Чувствительность – обеспечивает ПЦР качественный и количественный анализ. С его помощью можно определить количество и вид возбудителя, имея только фрагмент ДНК или минимальное ее количество.
4. Быстрота – от момента забора материала до того, как специалист сможет расшифровать и выдать результат, проходит всего 1 день.

Как и любой метод диагностики, ПЦР не лишен некоторых недостатков:

• необходимо строго соблюдать технику проведения анализа;
• важно иметь хорошее оборудование и правильно оснащенную лабораторию;
• проведение анализа, забор материала и интерпретацию результатов должен выполнять специалист с опытом и высокой квалификацией.

Часто ложный результат обусловлен человеческим фактором.